Javascript ist derzeit in Ihrem Browser deaktiviert.Mehrere Funktionen dieser Website funktionieren nicht, wenn Javascript deaktiviert ist.freier Zugang zu wissenschaftlicher und medizinischer ForschungVon der Einreichung bis zur ersten redaktionellen Entscheidung.Von der redaktionellen Abnahme bis zur Veröffentlichung.Der oben genannte Prozentsatz an Manuskripten wurde in den letzten 12 Monaten abgelehnt.Peer-reviewte wissenschaftliche und medizinische Open-Access-Zeitschriften.Dove Medical Press ist Mitglied des OAI.Massennachdrucke für die pharmazeutische Industrie.Wir bieten unseren Autoren echte Vorteile, einschließlich einer beschleunigten Bearbeitung von Papieren.Registrieren Sie Ihre spezifischen Daten und spezifischen Arzneimittel von Interesse und wir gleichen die von Ihnen bereitgestellten Informationen mit Artikeln aus unserer umfangreichen Datenbank ab und senden Ihnen umgehend PDF-Kopien per E-Mail zu.Zurück zu Zeitschriften » Wirkstoffdesign, -entwicklung und -therapie » Band 16Autoren Cheng JJ, Ma XD, Ai GX, Yu QX, Chen XY, Yan F, Li YC, Xie JH, Su ZR, Xie QFVeröffentlicht am 2. Juli 2022 Band 2022:16 Seiten 2119–2132DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S356307Begutachtung durch einmaliges anonymes Peer-ReviewHerausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Dr. Tuo DengJuan-Juan Cheng, 1 Xing-Dong Ma, 1 Gao-Xiang Ai, 1 Qiu-Xia Yu, 2 Xiao-Ying Chen, 1 Fang Yan, 3,4 Yu-Cui Li, 1 Jian-Hui Xie, 3,5 ,6 Zi-Ren Su,1 Qing-Feng Xie3,4 1School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510006, Volksrepublik China;2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510120, Volksrepublik China;3The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510120, Volksrepublik China;4Li Ke und Qi Yu-ru Academic Experience Inheritance Studio, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou, 510006, Volksrepublik China;5State Key Laboratory of Dampness Syndrome of Chinese Medicine, Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510120, Volksrepublik China;6Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Research on Traditional Chinese Medicine Syndrome, Guangzhou, 510120, Volksrepublik China Korrespondenz: Qing-Feng Xie;Zi-Ren Su, E-Mail [email protected];[email protected] Zweck: Gichtarthritis könnte durch die Ablagerung von Mononatrium-Harnsäure (MSU)-Kristallen ausgelöst werden.Palmatine (PAL), ein Protoberberin-Alkaloid, hat nachweislich überzeugende gesundheitsfördernde Wirkungen.In dieser Studie wollten wir die Wirkung von PAL auf durch LPS plus MSU-Kristalle stimulierte Gichtarthritis in vitro und in vivo untersuchen.Methoden: PMA-differenzierte THP-1-Makrophagen wurden mit LPS geprimt und dann mit MSU-Kristall in Anwesenheit oder Abwesenheit von PAL stimuliert.Die Expression von entzündungsfördernden Zytokinen und Biomarkern im Zusammenhang mit oxidativem Stress sowie Schlüsselzielen des Signalwegs wurden durch ELISA-Kit, Western Blot, Immunhistochemie bzw. qRT-PCR bestimmt.Zusätzlich wurden auch die entzündungshemmenden und antioxidativen Aktivitäten von PAL bei MSU-induzierten Arthritis-Mäusen bewertet.Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigten, dass PAL (20, 40 und 80 μM) dosisabhängig die mRNA-Expression und die Spiegel entzündungsfördernder Zytokine (Interleukin-1beta (IL-1β), IL-6, IL-18 und Tumornekrosefaktor) verringerte alpha (TNF-α)).Die Konzentrationen von Superoxiddismutase (SOD) und Glutathion (GSH) waren bemerkenswert erhöht, während die Konzentration von Malondialdehyd (MDA) verringert war.Die Western-Blot-Analyse ergab, dass PAL die NF-κB/NLRP3-Signalwege durch Hemmung der Phosphorylierung von p-65 und IκBα, die Blockierung der Expression von NLRP3, ASC, IL-1β und Caspase-1 sowie die Verstärkung der antioxidativen Proteinexpression deutlich hemmte von Nrf2 und HO-1.In vivo schwächte PAL die MSU-induzierte Entzündung bei Gichtarthritis ab, wie durch die Linderung der Gelenkschwellung und die Verringerung der Produktion von IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α und MDA belegt wurde, während die SOD-Spiegel erhöht wurden und GSH.Darüber hinaus schwächte PAL die Infiltration von Neutrophilen in die Gelenksynovitis weiter ab.Schlussfolgerung: PAL schützte vor MSU-induzierter Entzündung und oxidativem Stress durch Regulierung der NF-κB/NLRP3- und Nrf2-Wege.PAL könnte ein potenzieller Kandidat für die Behandlung von Gichtarthritis sein.Schlüsselwörter: Palmatin, NF-κB/Nrf2-Signalwege, NLRP3-Inflammasom, GichtarthritisIn den letzten Jahren ist Gichtarthritis oder Gicht eine der häufigsten Stoffwechselerkrankungen.Die Zahl der Gichtpatienten nimmt mit der Alterung der Bevölkerung und der Änderung des Lebensstils allmählich zu, insbesondere bei Männern und postmenopausalen Frauen.1 Sie zeigen normalerweise extreme Schmerzen, Erytheme, Rötungen und Gelenkschwellungen.2 Wenn das Gelenk nicht rechtzeitig behandelt wird, es wird steif und deformiert, was ihre finanzielle Belastung erheblich erhöhen, ihre Lebensqualität beeinträchtigen und sogar zu Handlungsunfähigkeit führen kann.3Das Kennzeichen für die Diagnose dieser Erkrankung ist die Ausfällung von Mononatriumurat (MSU)-Kristallen im Gelenk- oder periartikulären Gewebe.4 Dem NLRP3-Inflammasom wurde bei der Entwicklung von MSU-induzierter Gichtarthritis besondere Aufmerksamkeit geschenkt.4 Es besteht aus NLRP3, Apoptose -assoziiertes fleckenartiges Protein, das eine CARD (ASC) und Pro-Caspase-1.5 enthält. Die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms erfordert einen zweistufigen Prozess.6 Das erste Priming-Signal ist, dass Lipopolysaccharid (LPS) den Kernfaktor-κB (NF- κB)‐Signalweg, der die Expression von Inflammasom‐Komponenten wie NLRP3 und pro‐IL‐1β fördert.7 Das zweite Aktivierungssignal besteht darin, dass Mononatriumurat(MSU)‐Kristalle von Makrophagen aufgenommen werden, was den Zusammenbau und die Aktivierung von fördert NLRP3-Inflammasom.5Darüber hinaus wurde die MSU-induzierte Gichtentzündung durch spezifische Mechanismen vermittelt, die am Nuklearfaktor-Erythroid-2-bezogenen Faktor 2 (Nrf2)-Signalweg beteiligt waren, der eine negative regulatorische Wirkung auf die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms hat.8–10 Zusammenfassend ist dies der Fall bietet eine Richtung zum Verständnis der Pathogenese der Gichtarthritis und zur Suche nach Arzneimitteln mit entzündungshemmenden und antioxidativen Eigenschaften für eine gezielte Therapie.Palmatine (C21H25NO4, PAL, Abbildung 1A), eines der wichtigsten aktiven Protoberberin-Alkaloide in Cortex Phellodendri,11 existiert in medizinischen Pflanzen wie Corydalis yanhusuo und Aristolochiae Herba usw.12 PAL wurde als entzündungshemmendes Mittel zur Heilung gynäkologischer Entzündungen verwendet , Enteritis und Konjunktivitis in der klinischen Praxis.13,14 Darüber hinaus hat es aufgrund seiner entzündungshemmenden und antioxidativen Eigenschaften, die durch NF- κB/Nrf2-Signalwege und NLRP3-Inflammasom.15–17Abbildung 1 (A) Chemische Struktur von PAL.(B) Wirkung von PAL auf die Zelllebensfähigkeit von THP-1-Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt.Abbildung 1 (A) Chemische Struktur von PAL.(B) Wirkung von PAL auf die Zelllebensfähigkeit von THP-1-Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt.Darüber hinaus wurde festgestellt, dass PAL eine schützende Wirkung auf das experimentelle Osteoarthritis-Kaninchenmodell ausübt und eine potenzielle schmerzlindernde Wirkung besitzt.18,19 Es wurde auch festgestellt, dass es ein Xanthinoxidase-Hemmer mit potenzieller Anwendung bei der Behandlung von Hyperurikämie ist.20 Ob PAL entzündliche Reaktion auf MSU-induzierte Gichtarthritis lindern könnte, war unklar.Daher unternahm die vorliegende Studie ein bahnbrechendes Unterfangen, um die potenzielle Wirkung und den zugrunde liegenden Mechanismus von PAL bei LPS plus MSU-Kristall-induzierter Entzündung in THP-1-Zellen und MSU-Kristall-induzierter Gichtarthritis bei Mäusen zu untersuchen.Palmatine (PAL, Reinheit > 98 %, die chemische Struktur ist in 1A gezeigt) wurde von Xi'an Ruilin Pharmaceutical (Xi'an, China) bereitgestellt.Colchicin (Col, Reinheit > 98 %, MB1063) wurde von Dalian Meilun Biotechnology Co., LTD (Dalian China) erworben.Lipopolysaccharid (LPS, L4391), Phorbolmyristatacetat (PMA, P1585) und Mononatriumurat (MSU, U2875) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.RPMI1640-Medium, fötales Rinderserum (FBS) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurden von Gibco (Grand Island, NY, USA) bezogen.THP-1-Zellen wurden von der Central South University (Hunan, China) erhalten, die die Qualifikation der nationalen Laborqualifikation (Messzertifikat, Zertifikatsnummer: 170021002479) und das Laborakkreditierungszertifikat des China National Accreditation Service for Conformity Assessment (Zertifikat Nummer: CNAS L10220).Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, bei 37 °C und 5 % (v/v) CO 2 kultiviert.THP-1-Zellen wurden durch 24-stündige Inkubation mit 50 nM PMA zu Makrophagen differenziert.Um die Wirkung von PAL auf THP-1-Zellen zu beurteilen, wurde ein 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wie zuvor beschrieben durchgeführt.21Kurz gesagt wurden Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen/Vertiefung ausgesät, bis sie eine Dichte von 90 % erreichten.Verschiedene Konzentrationen von PAL (2,5–80 μM) wurden für 24 h zu jeder Vertiefung gegeben.PAL wurde in DMSO gelöst und die Endkonzentration von DMSO betrug 0,1 %.Danach wurde das Medium dekantiert und 20 μL Lösung (5 mg/mL in PBS-Puffer) ersetzt.Nach Inkubation bei 37°C für 4 h wurde der Überstand entfernt und 150 &mgr;l DMSO wurden zu jeder Vertiefung für 15 min bei 37°C zugegeben.Zur Berechnung der relativen Zellviabilität wurde die Platte spektrometrisch bei 570 nm unter leichtem Schütteln bestimmt und die relative Viabilität in der unbehandelten Kontrolle auf 100 % ausgelegt.THP-1-Zellen wurden zuerst mit LPS-Stimulation (500 ng/ml) für 4 h geprimt.Und dann wurde PAL (20, 40, 80 &mgr;M) für 1 h zum Zellkulturmedium gegeben, gefolgt von Stimulation mit MSU (200 &mgr;g/ml) für 5 h.Col (1 μM) diente gemäß dem vorherigen Bericht als Positivkontrolle.21Männliche KM-Mäuse (6–8 Wochen alt) mit einem Gewicht von 20 ± 2 g wurden vom Laboratory Animal Center der Guangzhou University of Chinese Medicine (GZUCM, Guangzhou, China) gekauft.Um sich an die neue Umgebung zu gewöhnen, wurden alle Tiere für 12 h bei 22–24 °C in der spezifischen pathogenfreien (SPF) Umgebung unter einem Licht-/Dunkel-Zyklus gehalten und erhielten für die Dauer freien Zugang zu Futter und Wasser des Experiments.Die experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Guangzhou University of Chinese Medicine (NO. 20210113001) genehmigt wurden.Die Überstände der Zellen und des Serums wurden gesammelt, um die Spiegel von TNF-α (#ml002095), IL-1β (#ml063132), IL-18 (#ml002294) und IL-6 (#ml063159) durch Maus-Enzym-gebunden zu bestimmen Immunosorbent Assay (ELISA)-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China).Darüber hinaus wurde das Zelllysat zur Bestimmung der enzymatischen Antioxidantien von Superoxiddismutase (SOD, #A001-3), Glutathion (GSH, #A006-2) und des Malondialdehydgehalts (MDA, #A003-1) verwendet. B. durch Verwendung entsprechender kommerziell erhältlicher Assay-Kits (Jiancheng Company, Nanjing, China).Gesamt-RNA wurde aus THP-1-Zellen mit Trizol-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.Gesamt-RNA wurde mit dem PrimerScript RT Reagenzkit (#R222-01, Vazyme Biotech Co. Ltd., Nanjing, China) revers in cDNA transkribiert.Genprimer wurden unter Verwendung der NCBI/Primer-BLAST-Tool-Software entworfen und von Shanghai Bioengineering (Shanghai, China) synthetisiert (Tabelle 1).Danach wurde die cDNA für die Echtzeit-PCR-Amplifikation wie folgt verwendet: 95°C für 3 min, gefolgt von 39 Zyklen bei 95°C für 10 s, 60°C für 10 s und 72°C für 20 s und ein Finale Einzelzyklus bei 95°C für 10 Sek.Die Zielgenexpressionsniveaus wurden unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode berechnet und GAPDH wurde als Referenz für die Normalisierung verwendet.Tabelle 1 PrimersequenzenDie Zellen wurden geerntet und in eiskaltem RIPA (Radio-Immunopräzipitations-Assay)-Puffer, gemischt mit Cocktail und PMSF, für 30 Minuten lysiert.Zur Messung der Proteinkonzentration wurde das BCA-Protein-Assay-Kit (BB-3401, Shanghai Beibo Biotechnology, Shanghai, China) verwendet.Dann wurden gleiche Proteinmengen durch 7,5 % bis 12,5 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und dann auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen.Nach Blockierung mit 5 % Magermilch für 2 h bei Raumtemperatur wurden die Membranen mit geeigneten Primärantikörpern gegen p-NF-κB p65 (CST, #3033S, 1:1000), NF-κB p65 (CST, #8242S, 1:1000), p-IKB-α (GeneTex, Nr. 32224, 1:1000), IKB-α (GeneTex, Nr. 110521, 1:1000), NLRP3 (Abcam, Nr. ab263889, 1:1000), ASC (Affinity , #DF6304, 1:500), IL-1β (Affinität, #AF5103, 1:1000), Caspase-1 (Affinität, #AF5418, 1:1000), Nrf2 (Affinität, #AF0639, 1:1000), HO –1 (Affinity, #AF5393, 1:1000) und β-Actin (Affinity, #AF7018, 1:1000) über Nacht bei 4°C.Anschließend wurden die Membranen mit sekundärem HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Immunoglobulin G, Affinity, #072102, 1:5000) für 1 h inkubiert.Proteinbanden wurden unter Verwendung des Nachweissystems für verstärkte Chemilumineszenz (ECL) (Tanon 4200SF, China) sichtbar gemacht.Die Intensität der Banden wurde mit dem Tool ImageJ Software (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) bewertet.Gichtarthritis-Modell bei Mäusen wurde wie zuvor beschrieben etabliert.22,23 Sechzig Mäuse wurden zufällig in die folgenden sechs Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Modellgruppe, Col (1 mg/kg)-Gruppe, PAL-L (25 mg/kg)-Gruppe , PAL-M (50 mg/kg)-Gruppe und PAL-H (100 mg/kg)-Gruppe.Vor der Injektion von MSU wurde PAL (gelöst in 0,9 % NaCl) bzw. Col (gelöst in PBS) der Behandlungsgruppe oral verabreicht.Die PAL-Dosierungen wurden gemäß unserem vorangegangenen Bericht und unserem Pilotversuch ausgewählt.24 Col diente als Positivkontrolle.25 Eine Stunde später wurde die MSU-Kristallsuspension (0,1 mg/20 μl PBS pro Maus) oder PBS allein injiziert das linke Kniegelenk jeder Maus.Die Gelenkschwellung jeder Maus zu verschiedenen Zeitpunkten wurde mit einem elektronischen Messschieber gemessen.Nach 24 h wurden die Gelenkgewebe in RIPA-Puffer homogenisiert und dann 15 min bei 12.000 U/min zentrifugiert.Die Überstände wurden für TNF-α-, IL-1β-, IL-18- und IL-6-Assays verwendet.Am Ende des Experiments wurden die Gelenkgewebe für mehr als 24 h in 4 % Paraformaldehyd fixiert.Dann wurden die Proben in Paraffin eingebettet, die für die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung in 5 &mgr;m geschnitten wurden.Der histologische Score wurde gemäß dem vorherigen Bericht durchgeführt.26Die Probenschnitte wurden entparaffiniert, mit unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen rehydriert und mit PBS gewaschen.Dann wurden die Objektträger über Nacht bei 4°C mit primären Antikörpern inkubiert.Danach wurden Gewebeschnitte mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert und mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) gefärbt, gefolgt von Hämatoxylin-Gegenfärbung.Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt.Die Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von LSD oder Dunnett-Test unter Verwendung der SPSS-Software (Version 20.0, SPSS, Chicago, IL, USA) analysiert.P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.Wie in 1B gezeigt, zeigte PAL bei einer Konzentration von bis zu 80 &mgr;M keine signifikante zytotoxische Wirkung auf die Lebensfähigkeit von THP-1-Zellen nach 24-stündiger Inkubation (P > 0,05).Daher wurden 20, 40 und 80 &mgr;M PAL in den nachfolgenden Experimenten gemäß unseren Vorexperiment-Ergebnissen verwendet.Gemäß früheren Berichten wurde 1 μM Col als positive Kontrolle verwendet.21,27Wie in Abbildung 2 gezeigt, erhöhte die Behandlung mit LPS (500 ng/ml) und MSU (200 μg/ml) die Produktion von IL-1β, TNF-α, IL-18 und IL-6 im Überstand signifikant (alle P < 0,01). , im Vergleich zur Kontrollgruppe.Nichtsdestotrotz wurden diese Veränderungen durch PAL und Col dosisabhängig rückgängig gemacht (alle P < 0,01).Die obigen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die entzündungshemmende Wirkung von PAL mit seiner Regulation der Produktion von entzündungsfördernden Mediatoren in Verbindung stehen könnte.Abbildung 2 Wirkungen von PAL und Col (1 µM) auf die Spiegel von IL-1β (A), TNF-α (B), IL-6 (C) und IL-18 (D) in LPS plus MSU-aktiviertem THP- 1 Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;**P < 0,01 vs. Modellgruppe.Abbildung 2 Wirkungen von PAL und Col (1 µM) auf die Spiegel von IL-1β (A), TNF-α (B), IL-6 (C) und IL-18 (D) in LPS plus MSU-aktiviertem THP- 1 Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;**P < 0,01 vs. Modellgruppe.Um die inhibitorische Wirkung von PAL auf die mRNA-Expression von IL-1β, TNF-α, IL-6 und IL-18 weiter zu untersuchen, wurde eine RT-PCR-Analyse durchgeführt.Wie in Abbildung 3 dargestellt, war im Gegensatz zur Kontrollgruppe die Expression von IL-1β, TNF-α, IL-6 und IL-18 signifikant hochreguliert (alle P < 0,01).In der Zwischenzeit wurden diese Änderungen durch PAL und Col (P < 0,01) in einer dosisabhängigen Weise auffallend umgekehrt.Abbildung 3 Wirkungen von PAL und Col (1 µM) auf die mRNA-Expression von IL-1β (A), TNF-α (B), IL-6 (C) und IL-18 (D) in LPS plus MSU-aktiviertem THP- 1 Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Abbildung 3 Wirkungen von PAL und Col (1 µM) auf die mRNA-Expression von IL-1β (A), TNF-α (B), IL-6 (C) und IL-18 (D) in LPS plus MSU-aktiviertem THP- 1 Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Wie in Abbildung 4 gezeigt, war die Produktion von MDA auch in der Modellgruppe parallel zu der der Kontrollgruppe dramatisch erhöht (P < 0,01).Im Gegensatz dazu waren die Werte der antioxidativen Enzyme (SOD und GSH) im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe signifikant unterdrückt (alle P < 0,01).Die Behandlung mit PAL erhöhte jedoch die SOD- und GSH-Spiegel dosisabhängig signifikant.Bemerkenswerterweise gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Wirkungen von PAL (80 &mgr;M) und Col in LPS plus MSU-induzierten THP-1-Zellen.4 Wirkungen von PAL und Col (1 &mgr;M) auf die Konzentrationen von SOD (A), MDA (B) und GSH (C) in LPS plus MSU-aktivierten THP-1-Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.4 Wirkungen von PAL und Col (1 &mgr;M) auf die Konzentrationen von SOD (A), MDA (B) und GSH (C) in LPS plus MSU-aktivierten THP-1-Zellen.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Wenn Makrophagen LPS ausgesetzt werden, kann es den NF-κB-Signalweg aktivieren und mehrere entzündungsfördernde Faktoren freisetzen.28 Um weiter zu untersuchen, ob die entzündungshemmende Wirkung von PAL mit den beiden Signalwegen assoziiert ist, wurde die Expression mehrerer Schlüsselproteine ​​untersucht .Wie in Abbildung 5A, B und DI gezeigt, war die Expression von p-p65, p-IKBα, NLRP3, ASC, IL-1β und Caspase-1 (alle P < 0,01) in der Modellgruppe dramatisch erhöht.Dennoch blockierte die Behandlung mit PAL in verschiedenen Konzentrationen ihre Expression in unterschiedlichem Ausmaß und stoppte dosisabhängig die Aktivierung von NF-κB und NLRP3.Abbildung 5 Wirkungen von PAL und Col (1 µM) auf die NF-κB/NLRP3- und Nrf2-Signalwege in LPS plus MSU-aktivierten THP-1-Zellen.(A) Repräsentative Western-Blotting-Bilder von p-p65, p65, p-IKBα, IKBα und β-Aktin.(B) Repräsentative Western-Blotting-Bilder von NLRP3, ASC, IL-1β, Caspase-1 und β-Aktin.(C) Repräsentative Western-Blotting-Bilder von Nrf2, HO-1 und β-Aktin.Änderungen der relativen Proteinexpressionsniveaus von p-p65/p65 (D), p-IKBα/IKBα (E), NLRP3 (F), ASC (G), IL-1β (H), Caspase-1 (I), Nrf2 (J) und HO-1 (K).Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Abbildung 5 Wirkungen von PAL und Col (1 µM) auf die NF-κB/NLRP3- und Nrf2-Signalwege in LPS plus MSU-aktivierten THP-1-Zellen.(A) Repräsentative Western-Blotting-Bilder von p-p65, p65, p-IKBα, IKBα und β-Aktin.(B) Repräsentative Western-Blotting-Bilder von NLRP3, ASC, IL-1β, Caspase-1 und β-Aktin.(C) Repräsentative Western-Blotting-Bilder von Nrf2, HO-1 und β-Aktin.Änderungen der relativen Proteinexpressionsniveaus von p-p65/p65 (D), p-IKBα/IKBα (E), NLRP3 (F), ASC (G), IL-1β (H), Caspase-1 (I), Nrf2 (J) und HO-1 (K).Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Um den Mechanismus weiter zu untersuchen, der der schützenden Wirkung von PAL auf LPS plus MSU-induzierten oxidativen Stress zugrunde liegt, wurde die Proteinexpression von Nrf2 und HO-1 gemessen.Wie in Abbildung 5C, J und K gezeigt, wurde die Proteinexpression von Nrf2 und HO-1 in der Modellgruppe im Vergleich zu der normalen Kontrollgruppe signifikant herunterreguliert.PAL stellte jedoch die Proteinexpression von Nrf2 und HO-1 signifikant wieder her (P < 0,05).Im Allgemeinen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Schutzwirkung von PAL vor oxidativen Schäden mit der Aktivierung der antioxidativen Nrf2/HO-1-Antwort verbunden war.Insgesamt könnte die therapeutische Wirkung von PAL mit der Unterdrückung der NF-κB/NLRP3-Aktivierung und des Nrf2-Signalwegs zusammenhängen.Anschließend untersuchten wir die Rolle von PAL und Col bei MSU-induzierter Gichtarthritis.Nachdem Mäusen verschiedene Konzentrationen von Testartikeln oral verabreicht wurden, wurden MSU-Kristalle (0,1 mg) in die Kniegelenke von Mäusen injiziert (Fig. 6A).Wie in Abbildung 6B gezeigt, gab es eine offensichtliche Schwellung in der Modellgruppe nach der Injektion von MSU.In den PAL- und Col-Behandlungsgruppen war die Schwellung jedoch signifikant verringert.Abbildung 6 PAL unterdrückte die MSU-induzierte Gichtarthritis.Mäusen wurden entweder 25 mg/kg (L), 50 mg/kg (M) und 100 mg/kg (H) PAL, PBS (Con) oder 1 mg/kg Col (positive Kontrollgruppe) oral verabreicht.Nach 1 h wurde entweder Mononatriumurat (MSU)-Kristall in 0,1 mg/10 &mgr;l PBS oder PBS allein in das linke Kniegelenk jeder Maus injiziert.PAL verringerte die durch MSU-Kristalle induzierte akute Gichtentzündung bei Mäusen: (A) Schematisches Diagramm des in vivo-Versuchsprotokolls.(B) Zunahme der Gelenkschwellung zu verschiedenen Zeitpunkten.(C) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von Leukozyten in Gelenkgeweben (schwarzer Pfeil).(D) Histologische Bewertung.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) ausgedrückt, ##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Abbildung 6 PAL unterdrückte die MSU-induzierte Gichtarthritis.Mäusen wurden entweder 25 mg/kg (L), 50 mg/kg (M) und 100 mg/kg (H) PAL, PBS (Con) oder 1 mg/kg Col (positive Kontrollgruppe) oral verabreicht.Nach 1 h wurde entweder Mononatriumurat (MSU)-Kristall in 0,1 mg/10 &mgr;l PBS oder PBS allein in das linke Kniegelenk jeder Maus injiziert.PAL verringerte die durch MSU-Kristalle induzierte akute Gichtentzündung bei Mäusen: (A) Schematisches Diagramm des in vivo-Versuchsprotokolls.(B) Zunahme der Gelenkschwellung zu verschiedenen Zeitpunkten.(C) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von Leukozyten in Gelenkgeweben (schwarzer Pfeil).(D) Histologische Bewertung.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) ausgedrückt, ##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Die Infiltration einer großen Anzahl von Neutrophilen in den Gelenkspalt wurde als offensichtliches Merkmal von Gichtarthritis angesehen.29 Wie in der histologischen Untersuchung (Abbildung 6C) gezeigt, gab es in der Modellgruppe offensichtlich neutrophile Zellen, die zu Synovium und Gelenk rekrutiert wurden Hohlraum verursacht durch MSU-Kristalle.Die orale Gabe von 25, 50 und 100 mg/kg PAL schwächte jedoch die Infiltration von Neutrophilen in die Synovialhöhle signifikant ab.Der mikroskopische Score (Abbildung 6D) der PAL-Gruppen (25, 50 und 100 mg/kg) wurde ebenfalls dosisabhängig (alle P < 0,01) beobachtbar gesenkt.Es wurde auch beobachtet, dass Col die MSU-induzierte Infiltration von Neutrophilen signifikant umkehrte.Wie in Abbildung 7 dargestellt, unterdrückte PAL im Vergleich zur Modellgruppe den Anstieg der IL-1β-, TNF-α-, IL-6- und IL-18-Spiegel (alle P < 0,01) in den Gelenkgeweben, denen MSU-Kristalle injiziert wurden.Bemerkenswerterweise gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den entzündungshemmenden Wirkungen von PAL (100 mg/kg) und Col in Gelenkgeweben.Fig. 7 Spiegel von IL-1β (A), TNF-α (B), IL-6 (C) und IL-18 (D) in Gelenkgeweben, gemessen durch ELISA.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) ausgedrückt, ##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Fig. 7 Spiegel von IL-1β (A), TNF-α (B), IL-6 (C) und IL-18 (D) in Gelenkgeweben, gemessen durch ELISA.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) ausgedrückt, ##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;*P < 0,05, **P < 0,01 vs. Modellgruppe.Wie in Abbildung 8 gezeigt, war die Produktion von MDA im Vergleich zur Kontrollgruppe in der Modellgruppe dramatisch erhöht (P < 0,01).Im Gegensatz dazu waren die Werte der antioxidativen Enzyme (SOD und GSH) im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe signifikant unterdrückt.Die Behandlung mit PAL verringerte jedoch signifikant den MDA-Spiegel (alle P < 0,01), erhöhte die Aktivitäten von SOD und GSH in dosisabhängiger Weise.Bemerkenswert war, dass die Wirkung von PAL (100 mg/kg) im Gelenkgewebe mit der von Col vergleichbar war.Abbildung 8 Wirkungen von PAL und Col (1 mg/kg) auf die Konzentrationen von SOD (A), MDA (B) und GSH (C) im Gelenkgewebe.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;**P < 0,01 vs. Modellgruppe.Abbildung 8 Wirkungen von PAL und Col (1 mg/kg) auf die Konzentrationen von SOD (A), MDA (B) und GSH (C) im Gelenkgewebe.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) dargestellt;##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;**P < 0,01 vs. Modellgruppe.Kniegelenkschnitte wurden mit Ly6G- und/oder F4/80-Antikörper gefärbt, um Neutrophile und Makrophagen zu analysieren.Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten, dass MSU mehr Neutrophile und Makrophagen in das Kniesynovium rekrutierte, während PAL und Col die Infiltration von Neutrophilen und Makrophagen effektiv reduzierten (Abbildung 9).Die obigen Ergebnisse zeigten, dass PAL eine merkliche Hemmwirkung auf MSU-induzierte Arthritis besaß, und die Wirkung von PAL (100 mg/kg) schien der von Col nahe zu kommen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass PAL die Symptome von Gichtarthritis durch Verringerung der Infiltration lindern konnte der Immunzelle.Figur 9 Wirkungen von PAL und Col (1 mg/kg) auf die Infiltration von Entzündungszellen in vivo.(A) Repräsentative immunhistochemische Bilder von Kniegelenkabschnitten, die mit Ly6G oder F4/80 (roter Pfeil) gefärbt wurden.(B) Der Prozentsatz von Ly6G- oder F4/80-positiven Zellen relativ zu Gesamtzellen wurde berechnet.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt.##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;**P < 0,01 vs. Modellgruppe.Figur 9 Wirkungen von PAL und Col (1 mg/kg) auf die Infiltration von Entzündungszellen in vivo.(A) Repräsentative immunhistochemische Bilder von Kniegelenkabschnitten, die mit Ly6G oder F4/80 (roter Pfeil) gefärbt wurden.(B) Der Prozentsatz von Ly6G- oder F4/80-positiven Zellen relativ zu Gesamtzellen wurde berechnet.Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt.##P < 0,01 vs. Kontrollgruppe;**P < 0,01 vs. Modellgruppe.In den letzten Jahrzehnten hat die Inzidenz von Gichtarthritis weltweit zugenommen.30 Gegenwärtig sind Colchicin und Kortikosteroide die am häufigsten verwendeten Medikamente zur Vorbeugung und Behandlung von Gichtarthritis.31 Klinische Studien haben jedoch gezeigt, dass diese Mittel in der Regel viele unerwünschte Nebenwirkungen bei Patienten verursachen, einschließlich Magen-Darm-Blutungen, Magen-Darm-Toxizität und Nephrotoxizität.32Als akute entzündliche Erkrankung hat Gicht die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt.Es wurde festgestellt, dass einige Entzündungsfaktoren, wie IL-1β und IL-18, eine wesentliche Rolle beim Auftreten und der Entwicklung von akuter Gichtarthritis spielen.33 In Makrophagen müssen die inaktiven Vorläufer IL-1β und IL-18 von gespalten werden Caspase-1 aktiv werden.4 Sowohl TNF-α als auch IL-6 stehen in signifikantem Zusammenhang mit der Pathogenese der MSU-induzierten Entzündungsreaktion, deren Produktion durch IL-1β verstärkt werden kann.33 Verglichen mit gesunden Kontrollpersonen haben Patienten mit Gicht höhere Konzentrationen an Entzündungsfaktoren im Serum und anderen Geweben,34,35, die die Entzündungsreaktion weiter beschleunigen könnten.Frühere Studien haben gezeigt, dass PAL bei mehreren Krankheiten entzündungshemmend wirkt.24,36 Daher haben wir die potenzielle Rolle von PAL in LPS plus MSU-stimulierten THP-1-Zellen bewertet.Die ELISA- und qRT-PCR-Assays zeigten, dass PAL dosisabhängig die Produktion und mRNA-Expression von IL-1β, IL-18, TNF-α und IL-6 im Vergleich zur Modellgruppe reduzierte.Interessanterweise war die Wirkung von PAL (80 μM) ähnlich der von Col, was darauf hindeutet, dass PAL auch eine nennenswerte entzündungshemmende Wirkung hatte.Es wurde berichtet, dass Gicht von der Aktivierung des NF-κB-Signalwegs begleitet wird,37 der die Expression des NLRP3-Inflammasoms regulieren kann.38,39 Um den entzündungshemmenden Mechanismus von PAL weiter zu erforschen, untersuchten wir daher, ob PAL einen Einfluss hat NLRP3-Inflammasom-Aktivierung oder NF-κB-Weg.NF-κB dient als entscheidender Anfangsschritt, der die Expression von NLRP3-Inflammasomkomponenten auslöst, indem es die Expression von NLRP3, pro-IL-1β und pro-IL-18 hochreguliert.4 Yan et al. haben gezeigt, dass PAL eine entzündungshemmende Wirkung im Endometriumepithel von Ziegen ausübt Zellen zumindest teilweise über die Regulation des NF-κB-Signalwegs.16 In der vorliegenden Studie zeigten unsere Ergebnisse, dass PAL dosisabhängig die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs hemmte, indem es die Phosphorylierung von p-65 und IKB-α blockierte .Zhong et al. haben berichtet, dass Baicalin, ein Inhibitor von NLRP3, die durch MSU-Kristalle induzierte Entzündungsreaktion in vivo wirksam dämpfen könnte.22 Unsere frühere Studie hat gezeigt, dass PAL eine entzündungshemmende Aktivität aufweist, indem es die Expression von NLRP3-verwandten Proteinen bei Colitis ulcerosa herunterreguliert und THP-1-Zellen.24 Als Folgestudie untersuchten wir weiter die Wirkung von PAL auf das NLRP3-Inflammasom.In Übereinstimmung mit früheren Studien unterdrückte die Behandlung mit PAL die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in LPS plus MSU-geprimten Makrophagen dramatisch, wie durch die verringerte Proteinexpression von NLRP3, ASC, IL-1β und Caspase-1 belegt wurde.Zusammengenommen könnte die therapeutische Wirkung von PAL mit der Hemmung der NLRP3-Inflammasom-Assemblierung und der Aktivierung des NF-κB-Signalwegs zusammenhängen.Bemerkenswert war, dass PAL (80 μM) eine ähnliche entzündungshemmende Wirkung wie Col.Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Entzündungsreaktion eng mit dem oxidativen Stress verbunden ist.40 Der Nrf2-Signalweg könnte oxidativen Stress lindern, indem er seine nachgeschalteten antioxidativen Enzyme wie HO-1, SOD und GSH fördert.41,42 Frühere Berichte haben diese Transfektion vorgeschlagen mit dem Nrf2-Plasmid hemmte die NLRP3-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene stark, wodurch der Priming-Schritt der NLRP3-Inflammasom-Aktivierung gehemmt wurde.10 Proteinexpression von Nrf2 und HO-1.Interessanterweise war die Wirkung von PAL vergleichbar mit der von Col.Wir untersuchten dann, ob PAL im Gicht-Maus-Modell eine positive Wirkung ausüben könnte.Die Ergebnisse zeigten, dass die MSU-Kristallinjektion zu Gelenkschwellungen führte, die Produktion von IL-1β, IL-18, TNF-α und IL-6 erhöhte, die SOD- und GSH-Spiegel erhöhte, den MDA-Gehalt verringerte und die Infiltration von Neutrophilen in Gelenkgewebe verstärkte wie die histologische Untersuchung zeigt.Während PAL die Gelenkschwellung effektiv auf fast normale Werte verringerte und die Produktion von IL-1β, IL-18, TNF-α und IL-6 im Gelenkgewebe signifikant unterdrückte.Alle Rechte vorbehalten.